在各種ELISA方法中，夾心ELISA因其卓越的敏感性和特異性而被廣泛應(yīng)用于檢測二價或多價大分子抗原，在免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)研究中扮演著至關(guān)重要的角色。夾心ELISA法使用兩種針對不同表位的抗體來捕獲和檢測目標(biāo)抗原，大大提高了檢測的特異性。第一種抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲目標(biāo)抗原；第二種抗體則與酶聯(lián)結(jié)，用于檢測被捕獲的抗原。為了更詳細(xì)地了解夾心ELISA的原理和步驟，請繼續(xù)閱讀下文。

    夾心ELISA法原理

    夾心ELISA，又稱雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定，是一種高特異性和敏感的免疫分析技術(shù)，用于檢測體液中可溶性的大分子抗原。其原理是：首先將特異性捕獲抗體包被在酶標(biāo)板的固相載體表面，并用封閉液封閉未結(jié)合的位點。然后加入待測樣本，使樣本中的抗原與捕獲抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入針對目標(biāo)抗原不同表位的酶標(biāo)檢測抗體，使其與已結(jié)合的抗原結(jié)合。再次洗滌去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。最后加入酶的底物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的信號，如顏色變化或熒光。信號強度與抗原的濃度成正比。通過與預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可定量測定樣本中抗原的濃度。每次加樣后都需要進(jìn)行洗滌步驟，以減少非特異性結(jié)合的干擾。

    夾心ELISA法步驟

    包被抗體。在酶標(biāo)板（通常是96孔板）的每個孔中加入特定的捕獲抗體，該抗體能特異性結(jié)合目標(biāo)抗原。將孔位在室溫或4℃下孵育一段時間，使抗體牢固吸附到板上。完成之后，使用洗滌液洗去未結(jié)合的抗體。

    封閉處理。為了減少非特異性結(jié)合，需要將孔中加入封閉劑（如BSA或明膠），覆蓋未結(jié)合的表面。孵育一段時間后，再次洗滌去除未結(jié)合的封閉劑。

    樣本加入與孵育。將含有待測抗原的樣本加入到已包被和封閉的孔中。孵育一段時間，使樣本中的抗原與板上的抗原結(jié)合。孵育一段時間后，再次洗滌去除未結(jié)合的樣本成分。

    酶標(biāo)抗體添加。加入針對目標(biāo)抗原不同表位的、已與酶（如HRP）標(biāo)記的第二抗體。這個抗體將與第一步固定在板上的抗原結(jié)合，形成“夾心”結(jié)構(gòu)。孵育一段時間后，再次洗滌去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

    底物與顯色。加入酶的底物，如TMB或ABTS，酶標(biāo)抗體中的酶會催化底物產(chǎn)生顏色變化。顯色反應(yīng)在一定時間后終止，通常通過加入酸性溶液來停止反應(yīng)。

    讀取與分析。使用酶標(biāo)儀測量每個孔的顏色強度，通常是在特定波長下（如450nm）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（由已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品生成）計算未知樣本中抗原的濃度。

    上述是夾心ELISA法檢測步驟，理解這些原理和步驟對于成功進(jìn)行直接ELISA實驗至關(guān)重要。夾心ELISA法因其敏感性和特異性廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)研究中。相較于其他ELISA方法，夾心ELISA操作簡便、使用兩種抗體識別抗原的不同表位，大大提高了檢測的特異性，適用于復(fù)雜樣品檢測，這限制了該方法對一些小分子抗原的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，更高效、更靈敏的間接ELISA方法將不斷涌現(xiàn)，為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷提供更強大的工具。