細胞為什么傳代？如果繼續(xù)在同一容器中培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)密度會逐漸增加，導(dǎo)致細胞老化和細胞死亡。為了防止這種情況，將少量細胞移植到另一個容器中的過程稱為“傳代”。

 

  傳代程序根據(jù)細胞的性質(zhì)略有不同，因此請務(wù)必檢查哪種方法適合您正在處理的細胞。在本文中，我們將解釋三種模式的傳代程序：貼壁細胞、抗貼壁細胞和浮動細胞。

 

  貼壁細胞的傳代

 

  首先，我們來談?wù)勅绾蝹鞔N壁細胞。貼壁細胞在體外生長，直到培養(yǎng)容器的表面被細胞覆蓋或直到培養(yǎng)基耗盡營養(yǎng)。最好在細胞增殖到這種程度之前進行傳代。

 

  為了傳代細胞，首先將它們重組成懸浮液。盡管細胞附著程度因每個細胞系而異，但通常使用胰蛋白酶等蛋白酶將細胞從培養(yǎng)容器中分離出來。然而，這種方法可能并不適合所有細胞系，因為蛋白酶可能會干擾某些細胞系，或者酶可能會消化感興趣的膜標記物或受體蛋白。在這種情況下，另一種方法是用細胞刮刀等物理刮除細胞并將其添加到少量培養(yǎng)基中以產(chǎn)生懸浮液。

 

  貼壁細胞傳代步驟

 

  步驟一：檢查細胞狀態(tài)

 

  步驟二：從容器中取出介質(zhì)

 

  步驟三：用PBS(-)清洗（必要時重復(fù)）

 

  步驟四：添加胰蛋白酶/EDTA

 

  步驟五：孵育2-10分鐘

 

  步驟六：檢查細胞狀態(tài)

 

  步驟七：添加新鮮培養(yǎng)基并懸浮

 

  步驟八：在裝有溫?zé)崤囵B(yǎng)基的培養(yǎng)容器中播種

 

  步驟久放入培養(yǎng)箱中

 

  所需設(shè)備和試劑如下

 

  1、將培養(yǎng)基加熱至37°C（或細胞隨附的ECACC細胞系數(shù)據(jù)表上推薦的溫度）

 

  2、70%乙醇

 

  3、PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）

 

  4、0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液

 

  5、胰蛋白酶抑制劑

 

  6、臺盼藍

 

  7、孵化器

 

  8、培養(yǎng)容器和標簽

 

  9、倒置顯微鏡、相差顯微鏡

 

  10、離心機

 

  11、血球計數(shù)板（血球計數(shù)板）

 

  12、記號筆

 

  13、移液器

 

  14、用于放置小瓶的架子

 

  如何傳代貼壁細胞

 

  下面我們就來看看具體的步驟吧。

 

  步驟一、檢查細胞狀態(tài)

 

  使用顯微鏡觀察細胞的狀態(tài)（沒有細菌或真菌等污染物）和匯合度（大約匯合度的百分比）。

 

  步驟二、從容器中取出介質(zhì)

 

  打開抽吸器，用移液器吸取培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基并丟棄。吸取培養(yǎng)基時，稍微傾斜容器，從最深處吸取液體。最好從盡可能靠近培養(yǎng)皿或燒瓶側(cè)面的地方吸起。

 

 

  步驟三、用PBS清洗細胞

 

  用培養(yǎng)用大約一半體積的PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）清洗細胞表面。如果細胞牢固附著，請重復(fù)幾次。

 

  步驟四、添加胰蛋白酶/EDTA

 

  將1 mL胰蛋白酶/EDTA添加到25 cm的細胞表面進行清洗。緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，使胰蛋白酶均勻分布在細胞表面，然后丟棄多余的胰蛋白酶。

 

  步驟五、孵化

 

  將培養(yǎng)容器放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至10分鐘。

 

  步驟六、檢查細胞狀態(tài)

 

  在顯微鏡下觀察細胞并確認細胞開始漂浮。如有必要，用手指輕輕敲擊培養(yǎng)容器的側(cè)面以松開任何卡住的細胞。

 

  步驟七、添加新鮮培養(yǎng)基并懸浮

 

  將細胞重懸于含有少量血清的培養(yǎng)基中以滅活胰蛋白酶。但是，請注意，如果您使用無血清培養(yǎng)基，則需要使用胰蛋白酶抑制劑滅活胰蛋白酶。從懸浮液中取出約100-200μL，用臺盼藍等染色，并使用血細胞計數(shù)器對細胞進行計數(shù)。

 

  步驟八、在裝有溫?zé)崤囵B(yǎng)基的培養(yǎng)容器中播種

 

  用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基填充新標記的培養(yǎng)容器并轉(zhuǎn)移所需量的細胞。（請以ECACC細胞系數(shù)據(jù)表上記載的適量為標準。）

 

  步驟九、放入培養(yǎng)箱中

 

  在數(shù)據(jù)表中指定的適當(dāng)條件下孵育細胞。

 

  根據(jù)細胞的生長狀況重復(fù)上述步驟。

 

  貼壁細胞傳代技巧

 

  執(zhí)行此操作時需要記住幾點。首先，根據(jù)某些細胞系的生長水平，它們可能會輕微粘附在表面并容易脫落。經(jīng)常檢查培養(yǎng)容器內(nèi)的條件，注意不要在細胞尚未成熟時使細胞脫落。

 

  在步驟3中，用PBS(-)沖洗細胞表面，去除培養(yǎng)基中含有的血清。此步驟非常重要，因為胰蛋白酶在血清存在下不具有活性。

 

  當(dāng)對細胞使用胰蛋白酶/EDTA時，請使用分離細胞所需的最短處理時間。長時間接觸可能會損害細胞表面受體。非酶細胞分離劑（例如胰蛋白酶）也可用于分離細胞。建議在必要時使用它，例如當(dāng)您想在溫和的條件下去角質(zhì)時。

 

  將新細胞接種到培養(yǎng)容器中時，除非用血清中和胰蛋白酶，否則細胞不會粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制劑（例如源自大豆的抑制劑）也可用于中和胰蛋白酶。在這種情況下，首先將等體積的胰蛋白酶抑制劑（濃度1 mg/mL）添加到待中和的懸浮液中。然后，離心混合物，棄去上清液，并重懸于新鮮培養(yǎng)基中。當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，該過程特別有效。

 

  如果沒有CO 2培養(yǎng)箱，則用含有0.2μm過濾滅菌的5%CO 2空氣進行氣體交換1-2分鐘。

 

  如果收獲的細胞密度不夠，以150 x g離心5分鐘，然后重懸于少量培養(yǎng)基中。

 

  半貼壁細胞的傳代

 

  根據(jù)細胞系的類型，所有細胞可能不會粘附在培養(yǎng)容器上，并且可能部分培養(yǎng)為懸浮液。這些細胞必須傳代以維持其細胞狀態(tài)。

 

  所需的一般流程、設(shè)備和試劑與貼壁細胞相同，但詳細步驟有所不同。

 

  一、檢查細胞狀態(tài)

 

  使用顯微鏡觀察細胞的狀態(tài)（沒有細菌或真菌等污染物）和匯合度（大約匯合度的百分比）。此時，如果通過敲擊或搖動培養(yǎng)容器的側(cè)面將細胞從培養(yǎng)容器中提起，則不再需要胰蛋白酶處理。

 

  二、從容器中取出介質(zhì)

 

  用移液器去除含有非貼壁細胞的培養(yǎng)基。不要丟棄該介質(zhì)，而是將其保存在無菌離心管中。

  三、用PBS清洗細胞

 

  對于培養(yǎng)容器表面上剩余的每25 cm2細胞，用1-2 mL PBS(-)清洗細胞表面。將洗滌后的PBS(-)保存在單獨的管中。

 

  四、添加胰蛋白酶/EDTA

 

  用1 mL胰蛋白酶-EDTA清洗25 cm的細胞單層表面。緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，使胰蛋白酶遍布細胞表面，然后丟棄多余的胰蛋白酶。

 

  五、孵化

 

  將培養(yǎng)容器放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至10分鐘。

  六、檢查細胞狀態(tài)

 

  在顯微鏡下觀察細胞并確認細胞開始漂浮。如有必要，用手指輕輕敲擊培養(yǎng)容器的側(cè)面以松開任何卡住的細胞。

 

  七、添加新鮮培養(yǎng)基并懸浮

 

  將提起的細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入保留的培養(yǎng)基，并將整個懸浮液以150×g離心5分鐘。棄去上清液，將細胞沉淀重懸于少量新鮮培養(yǎng)基（10-20 mL）中，并對細胞進行計數(shù)。

 

  八、將細胞接種到新容器中

 

  將所需量的細胞放入新的培養(yǎng)容器中，并用新鮮培養(yǎng)基稀釋至所購買細胞數(shù)據(jù)表上建議的細胞密度。

 

  每2-3天重復(fù)一次上述步驟。

 

  基本的預(yù)防措施與貼壁細胞的預(yù)防措施沒有太大區(qū)別。

  大多數(shù)細胞被胰蛋白酶分離，但通過添加EDTA可以進一步增強效果。

 

  胰蛋白酶在血清存在下不具有活性。因此，在步驟3中，與貼壁細胞一樣，通過用PBS(-)沖洗細胞表面來除去培養(yǎng)基中含有的血清。反復(fù)加熱至37度也可能導(dǎo)致胰蛋白酶活性下降。

 

  此外，當(dāng)對細胞使用胰蛋白酶-EDTA時，處理時間應(yīng)保持最短，就像貼壁細胞一樣。對于半貼壁細胞，接觸胰蛋白酶的時間比正常貼壁細胞短得多。

 

  將新細胞接種到培養(yǎng)容器中時，除非用血清中和胰蛋白酶，否則細胞不會粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制劑（例如源自大豆的抑制劑）也可用于中和胰蛋白酶。

 

  如果沒有CO 2培養(yǎng)箱，則用含有0.2μm過濾滅菌的5%CO 2空氣進行氣體交換1-2分鐘。

 

  浮游細胞的傳代

 

  大多數(shù)浮游細胞是血細胞來源的細胞（淋巴細胞等），并在懸浮液中培養(yǎng)。這些細胞可以作為單個細胞或成簇生長（例如，EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細胞）。這種類型可以通過稀釋培養(yǎng)相對容易地傳代。然而，在某些情況下，例如形成團塊的細胞系，必須將細胞離心至單個細胞，然后在計數(shù)前重新懸浮。

 

  首先，讓我們檢查一下總體流程。請注意，僅當(dāng)步驟3適用時才會執(zhí)行標有星號(*)的步驟。

 

  1、檢查細胞狀態(tài)

 

  2、（150×g離心5分鐘）*

 

  3、（在新鮮培養(yǎng)基中添加約10-20%的條件培養(yǎng)基）*

 

  4、采集細胞樣本

 

  5、測量細胞密度，稀釋至適當(dāng)密度，并懸浮在新培養(yǎng)基中。

 

  6、每2-3天重復(fù)一次上述操作

 

  所需設(shè)備和試劑如下

 

  1、將培養(yǎng)基加熱至37°C（或細胞隨附的ECACC細胞系數(shù)據(jù)表上推薦的溫度）

 

  2、70%乙醇

 

  3、臺盼藍

 

  4、孵化器

 

  5、培養(yǎng)容器和標簽

 

  6、倒置顯微鏡、相差顯微鏡

 

  7、離心機

 

  8、血球計數(shù)板（血球計數(shù)板）

 

  9、記號筆

 

  10、移液器

 

  11、用于放置小瓶的架子

 

  如何傳代浮游細胞

 

  現(xiàn)在，我們就來看看具體的步驟。為了避免對細胞造成壓力，該方案建議通過將細胞添加到新的培養(yǎng)基中并傳代來稀釋細胞。另一種方法是離心，除去上清液，然后將細胞重懸于新鮮培養(yǎng)基中。

 

  一、檢查細胞狀態(tài)

 

  在顯微鏡下檢查細胞的狀態(tài)。如果細胞呈圓形、明亮且反光，則處于對數(shù)生長期。這時我們還要檢查是否有細菌、霉菌等污染物。

 

  二、分散細胞

 

  對于容易粘附在培養(yǎng)容器上的細胞，例如雜交瘤，可通過輕輕敲擊容器將其去除，或使用橡皮警察將其從容器中去除?；蛘?，通過移液分散細胞。這是因為EBV轉(zhuǎn)化的細胞可能形成單個大團塊，從而難以對中心的細胞進行計數(shù)。

 

  如何從過度生長中恢復(fù)

 

  如果更換前的培養(yǎng)基顏色呈酸性（含有酚紅的培養(yǎng)基變黃），則細胞可能已經(jīng)過度生長，恢復(fù)可能很困難。在這種情況下，可以通過以下方式進行恢復(fù)：以150 x g離心約5分鐘，以比所附數(shù)據(jù)表中推薦濃度稍高的細胞密度接種到新培養(yǎng)基中，并添加約10至20%的條件培養(yǎng)基。。

 

  1、采集細胞樣本并進行計數(shù)

 

  從細胞懸浮液中取出少量（100-200μL），用臺盼藍染色，并對細胞進行計數(shù)。計算每毫升的細胞數(shù)，將所需量放入新的培養(yǎng)容器中，并用新培養(yǎng)基稀釋至細胞隨附的數(shù)據(jù)表上推薦的細胞濃度。

 

  每2-3天重復(fù)一次上述步驟。

 

  如果培養(yǎng)的細胞系是雜交瘤或產(chǎn)生重組蛋白或生長因子的細胞，則傳代后的舊培養(yǎng)基也應(yīng)保留以供以后分析。

 

  步驟3中使用的條件培養(yǎng)基也稱為條件培養(yǎng)基。指細胞培養(yǎng)一定時間（數(shù)小時至數(shù)天）后收集的培養(yǎng)上清液。含有細胞生長因子、細胞粘附因子、細胞毒性中和因子等，可能有助于細胞增殖和功能表達。

 

  上面，我們已經(jīng)解釋了細胞傳代的步驟。除了細胞類型之外，不同的細胞系可能需要不同的程序和條件。實際使用細胞進行實驗時，請務(wù)必仔細閱讀細胞附帶的數(shù)據(jù)表，并在處理細胞時參考文獻。