ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是一種基于抗原抗體特異性結合的免疫學檢測方法，用于定量或定性檢測生物樣品中各種靶標物質，包括蛋白質、抗體、激素、肽類等。

  ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定) 是一種用于檢測液體樣品中靶向蛋白質的固相酶免疫測定 (EIA) 技術。在 ELISA 中，首先將靶向蛋白質（抗原）固定在固相載體表面，例如微孔板。然后，加入含有待測抗體的樣品，并與固定的抗原進行結合。未結合的抗體會被洗滌去除。隨后，加入酶標二抗，該二抗能夠特異性識別結合在抗原上的抗體。最后，加入底物溶液，底物會在酶的催化下發(fā)生顯色反應，顏色深淺與樣品中靶向蛋白質的濃度成正比，通過檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向蛋白質的含量。

  ELISA試劑盒自從60-70年代問世以來，得到全世界科研工作者的認可及推崇，在歐美及中國獲得很大的推廣，尤其是國內(nèi)生化領域的長足發(fā)展。

  ELISA生物實驗敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。ELISA一直被用作植物病理學、醫(yī)學和生物技術的重要工具之一。它是許多行業(yè)對其生物產(chǎn)品進行質量檢查的首選檢測方法。在96孔板中進行，可以在一次實驗中測量和研究多個樣品。它與其他抗體測定不同，因為它的數(shù)據(jù)再現(xiàn)性和定量結果。

  本文討論了酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的工作原理、其類型、優(yōu)點和局限性及其在生命科學實驗室和工業(yè)中的應用。

  酶聯(lián)免疫吸附測定原理

  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)的工作原理基于抗原抗體之間的特異性結合。抗體是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質，用于識別和結合特定的抗原，而抗原則可以是來自任何外來來源的分子，例如蛋白質、多肽、病毒等。

  在ELISA實驗中，通常使用特殊的固相載體，例如聚苯乙烯微孔板，其表面可以吸附抗原或抗體。大多數(shù)情況下，抗原會被固定在微孔板表面，然后加入含有待測抗體的樣品。如果樣品中存在與抗原特異性結合的抗體，則會與固定的抗原結合。未結合的抗體會被洗滌去除。隨后，加入酶標二抗，該二抗能夠特異性識別結合在抗原上的抗體。最后，加入底物溶液，底物會在酶的催化下發(fā)生顯色反應。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

圖1 elisa檢測原理

  ELISA試劑盒類型

  ELISA分為常見4種類型，分別是直接ELISA法、間接ELISA法、夾心ELISA法和競爭ELISA法。

  直接ELISA法

  直接ELISA法是一種簡單快速的ELISA方法，其原理是將抗原或蛋白質直接固定在固相載體表面，例如微孔板。然后，加入酶標抗體溶液，該抗體能夠特異性識別和結合固定的抗原。未結合的抗體會被洗滌去除。隨后，加入底物溶液，底物會在酶的催化下發(fā)生顯色反應。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

  雖然直接ELISA法操作簡單，但由于其只使用一種抗體，因此特異性可能較低，容易產(chǎn)生較高的背景信號，即更高的顯色或光密度讀數(shù)，這可能會影響實驗結果的準確性。

圖2 直接ELISA法

  間接ELISA法

  間接ELISA法的步驟與直接ELISA法相似，但增加了一個使用酶標二抗進行檢測的步驟，從而提高了檢測的靈敏度。在間接ELISA法中，首先將抗原或蛋白質固定在微孔板的孔中。然后，加入含有待測抗體（一抗）的樣品，并與固定的抗原進行結合。未結合的一抗會被洗滌去除。

  隨后，加入酶標二抗，該二抗能夠特異性識別并結合一抗。加入底物溶液后，底物會在酶的催化下發(fā)生顯色反應。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過檢測顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

  相比于直接ELISA法，間接ELISA法具有更高的靈敏度和更廣泛的應用范圍，因為可以使用多種不同的二抗進行檢測。

圖2 間接LEISA法

  夾心ELISA法

  夾心ELISA法是實驗室中最常用的ELISA類型之一，其靈敏度和特異性都較高。在夾心ELISA法中，首先將捕獲抗體固定在微孔板的孔中。然后，加入含有待測抗原的樣品，并與捕獲抗體進行結合。未結合的抗原會被洗滌去除。

  隨后，加入檢測抗體，該抗體能夠識別抗原上的不同表位，并與之結合。檢測抗體通常帶有酶標或熒光標記。最后，加入底物溶液，底物會在酶的催化下發(fā)生顯色反應或熒光反應。信號強度與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過檢測信號的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

  夾心ELISA法的優(yōu)勢在于其使用了兩種抗體來識別抗原，從而提高了檢測的特異性和靈敏度，降低了背景信號的干擾。

圖3 夾心ELISA法

  競爭法ELISA

  競爭ELISA法主要用于檢測小分子抗原，其原理與其他ELISA方法有所不同。在競爭ELISA法中，首先將抗原或抗原類似物固定在微孔板的孔中。然后，將待測樣品與酶標抗原或抗原類似物混合，并加入到微孔板中。樣品中的抗原與酶標抗原競爭性地與固定的抗原或抗原類似物結合。

  未結合的抗原和抗體會被洗滌去除。隨后，加入底物溶液，底物會在酶的催化下發(fā)生顯色反應。如果樣品中靶向抗原的濃度較高，則會與更多的酶標抗原競爭結合位點，導致酶標抗原的結合量減少，顯色反應較弱，信號強度較低。相反，如果樣品中靶向抗原的濃度較低，則酶標抗原的結合量會增加，顯色反應較強，信號強度較高。

  通過檢測信號強度與標準曲線的比較，可以定量分析樣品中靶向抗原的含量。競爭ELISA法的優(yōu)勢在于可以檢測小分子抗原，并且不需要制備針對小分子抗原的抗體。

  ELISA試劑盒檢測步驟

  以下是進行ELISA實驗的一般步驟。但需要根據(jù)具體實驗進行調(diào)整：

  準備工作

  準備包被緩沖液、封閉緩沖液、洗滌緩沖液、抗體溶液、底物溶液和終止液。

  將試劑盒從冰箱中取出，恢復至室溫。

  打開酶標儀預熱，設置檢測波長。

  包被

  向微孔板的孔中加入100μL肽溶液(4μg/mL，用包被緩沖液稀釋)。

  將板在37℃下孵育2小時或在4℃下孵育過夜。

  封閉

  除去包被溶液，并用100μL洗滌緩沖液(PBS-0.05%Tween20)洗滌3次。

  用紙巾擦干板子。

  向每個孔中添加100μL封閉緩沖液(3%脫脂牛奶的PBS溶液)。

  將板在37℃下孵育1小時。

  加樣

  用洗滌緩沖液洗滌板子3次。

  向每個孔中添加50μL稀釋的一抗溶液(稀釋比例根據(jù)具體實驗確定)。

  將板在37℃下輕輕搖動孵育1小時。

  洗滌

  重復洗滌步驟3次，每次使用100μL洗滌緩沖液。

  顯色

  向每個孔中添加50μL稀釋的酶標二抗溶液(稀釋比例根據(jù)具體實驗確定)。

  將板在37℃下孵育1小時。

  用洗滌緩沖液洗滌板子6次。

  將TMB底物溶液、乙酸和0.03%H2O2按照1:4:5的比例混合，制備顯色底物溶液。

  向每個孔中加入50μL顯色底物溶液。

  將板在37℃避光孵育15-30分鐘。

  終止反應

  顯色足夠后，向每個孔中添加100μL終止液。

  讀數(shù)

  使用酶標儀在指定的波長下讀取每個孔的吸光度值。

  ELISA檢測的優(yōu)點和局限性

  優(yōu)點：

  操作簡便：ELISA實驗方案簡單易行，只需進行基本的實驗操作，即可完成檢測。

  高通量：現(xiàn)如今ELISA可以使用96孔板或384孔板進行檢測，能夠同時處理大量樣品，提高檢測效率。

  靈敏度和特異性高：ELISA利用抗原抗體之間的特異性結合進行檢測，可以檢測到樣品中微量的靶標物質，并具有較高的特異性，能夠區(qū)分目標物質和其它相似物質。

  適用樣品類型廣泛：ELISA可以檢測各種類型的樣品，例如血清、血漿、細胞和組織提取物、尿液、唾液等。

  定量分析：ELISA可以通過標準曲線定量分析樣品中靶標物質的濃度，提供更精確的檢測結果。

  結果快速：ELISA實驗通?？梢栽跀?shù)小時內(nèi)完成，能夠快速獲得檢測結果。

  成本效益高：ELISA試劑盒價格相對便宜，操作簡單，無需昂貴的設備，因此具有較高的成本效益。

  局限性：

  結果易受影響：ELISA結果容易受到多種因素的影響，例如操作誤差、試劑質量、樣品處理等，需要嚴格控制實驗條件，確保結果的準確性。

  半定量檢測：雖然ELISA可以進行定量分析，但其準確性不如一些其他定量方法，例如質譜法。

  信息有限：ELISA只能檢測靶標物質的存在和含量，無法提供有關靶標物質結構、功能等信息。

  交叉反應：某些情況下，抗體可能與樣品中的其他物質發(fā)生交叉反應，導致假陽性結果。

  背景信號：ELISA實驗中可能會出現(xiàn)背景信號，影響檢測結果的準確性，需要進行適當?shù)男Ｕ?/span>

  Elisa試劑盒應用

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）作為一種靈敏、特異且用途廣泛的免疫學檢測方法，在生命科學、生物技術和醫(yī)學領域擁有廣泛的應用。以下列舉一些重要的應用領域：

  抗體和抗原檢測：ELISA可以用于檢測各種生物樣品中的抗體和抗原，例如血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液等。這使得ELISA成為研究免疫反應、疾病診斷和疫苗開發(fā)的重要工具。

  傳染病診斷：ELISA是許多傳染病診斷的金標準方法，例如HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。它可以檢測患者血清中的病毒抗原或抗體，幫助醫(yī)生進行早期診斷和治療。

  疾病監(jiān)測和流行病學研究：在疾病爆發(fā)期間，例如最近的COVID-19大流行，ELISA快速檢測試劑盒被廣泛用于評估疾病的傳播范圍和趨勢，為公共衛(wèi)生決策提供重要數(shù)據(jù)。

  食物過敏原檢測：ELISA可用于檢測食品中的過敏原，例如花生、牛奶、雞蛋、堅果等，幫助食品生產(chǎn)商確保食品安全，并為過敏人群提供指導。

  自身免疫性疾病診斷：ELISA可用于檢測自身免疫性疾病相關的自身抗體，例如類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，幫助醫(yī)生進行疾病診斷和監(jiān)測。

  藥物研發(fā)：ELISA在藥物研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用，例如用于藥物篩選、藥代動力學研究、毒理學研究等。

圖4 通蔚生物試劑盒

  最后，相信大家通過上文對ELISA試劑盒原理有所了解。通蔚提供多種經(jīng)濟實惠且有效的ELISA試劑盒，主要采用夾心法和競爭法，覆蓋3000個靶標，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個種類。