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發(fā)布時(shí)間：2023-12-28 發(fā)布作者：上海通蔚生物
酶聯(lián)免疫吸附測定 ( ELISA ) 是現(xiàn)有的最靈敏和可重復(fù)性最高的技術(shù)之一。這些測定快速、易于執(zhí)行且易于自動化。與任何檢測一樣，ELISA 的重現(xiàn)性和可靠性取決于正確的技術(shù)和對細(xì)節(jié)的關(guān)注。
ELISA技術(shù)分為：
直接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，一抗帶有標(biāo)記（圖 1 A）
間接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，二抗帶有標(biāo)記（圖 1 B）
三明治 ELISA，其中兩個(gè)一抗（用于捕獲和檢測）嵌入抗原，形成“三明治”，然后復(fù)合物被二抗標(biāo)記抗體識別（圖 1 C）。
圖 1. ELISA 格式的類型：A) 直接、B) 間接和 C) 夾心 ELISA。
匹配對是指已知可識別同一蛋白質(zhì)抗原上不同表位的抗體組，因此它們可以一起用于夾心 ELISA 中捕獲和檢測單個(gè)抗原。ELISA 測定中使用的抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或兩者的組合。
單克隆抗體可用于所有類型 ELISA 中所有含抗體的步驟。它們通常在夾心 ELISA 中成組使用，但也可與多克隆抗體結(jié)合用于捕獲或檢測，以增強(qiáng)信號或提供更大的從復(fù)雜溶液中捕獲抗原的機(jī)會。
由于多克隆抗體溶液中抗體的異質(zhì)性和表位的廣泛代表性，多克隆抗體可以成為檢測抗原的強(qiáng)大工具，通常比單克隆抗體產(chǎn)生更高的信號水平。然而，多克隆抗體更有可能與密切相關(guān)的蛋白質(zhì)共享一個(gè)或多個(gè)表位，從而導(dǎo)致更高的非特異性信號。減少該問題的一種方法是使用親和純化或交叉吸收的多克隆抗體。為了提高測定靈敏度，可以將 ELISA 的檢測方法從直接檢測轉(zhuǎn)換為使用多克隆抗體的間接檢測。
ELISA 可以測試多種樣品，測定條件的選擇將取決于樣品的復(fù)雜性和預(yù)期存在的抗原量。
重要的是要結(jié)合已知標(biāo)準(zhǔn)對所有樣品進(jìn)行一式兩份或三次測試，以確保結(jié)果和定量的準(zhǔn)確性。
最好測試樣品的幾種稀釋度，以確保最終結(jié)果落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分內(nèi)。高度濃縮的樣品可能會低估濃度，而高度稀釋的樣品可能會高估濃度。
通常需要進(jìn)行封閉，以防止檢測抗體與多孔板表面本身的非特異性結(jié)合。當(dāng)板完全封閉時(shí)，由于非特異性信號將減少，因此測定靈敏度將增強(qiáng)。
徹底的清洗程序?qū)τ讷@得可靠的 ELISA 結(jié)果至關(guān)重要。重要的是通過輕輕地將吸液頭放入底部來完全吸出所有孔中的液體。避免劃傷孔的內(nèi)部。清洗完成后，建議將板倒置并在吸水紙上擦干。
捕獲抗體濃度
在包被緩沖液中制備不同濃度的捕獲抗體。
阻塞緩沖區(qū)
準(zhǔn)備不同的封閉液。如果封閉液未預(yù)先配制（即，它是單一蛋白質(zhì)，例如 BSA），請嘗試不同濃度的蛋白質(zhì)。
標(biāo)準(zhǔn)稀釋液
盡量使標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑與樣品基質(zhì)盡可能匹配。
如果基質(zhì)本身不能精確復(fù)制，則測試不同的標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液并檢查樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋線性?？赡苄枰x擇不同的稀釋劑。
如果樣品的線性度較差，則樣品基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑之間可能存在不平衡。在這種情況下，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)回收或稀釋線性實(shí)驗(yàn)。
樣品濃度
準(zhǔn)備不同濃度的樣品，同時(shí)牢記底物的檢測限。為了確認(rèn)生物樣品基質(zhì)不會掩蓋或增強(qiáng)信號，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)和回收以及稀釋線性實(shí)驗(yàn)。
檢測抗體濃度
制備不同濃度的檢測抗體。
酶結(jié)合物濃度
根據(jù)底物描述的 ELISA 試劑盒范圍制備不同濃度的酶綴合物。
信號檢測
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