免疫檢測(cè)是一類(lèi)基于抗體-抗原特異性結(jié)合的生物化學(xué)和生物分析技術(shù)，用于定性和定量檢測(cè)各種生物樣品（例如溶液、細(xì)胞裂解物、組織、血液等）中特定靶標(biāo)分子的存在和濃度。這些靶標(biāo)分子主要為蛋白質(zhì)，但也包括與載體蛋白結(jié)合的小分子物質(zhì)，例如激素、藥物和毒素。ELISA和蛋白質(zhì)印跡法就是用于檢測(cè)蛋白質(zhì)配體的存在和濃度的技術(shù)。本文將為大家介紹ELISA和Western-blot同為檢測(cè)樣品中的特定蛋白質(zhì)的手段，有何異同。

  1.什么是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

  2.什么是蛋白質(zhì)印跡法

  3.ELISA與WesternBlot區(qū)別

  4.常見(jiàn)問(wèn)題解答

  一、酶聯(lián)免疫吸附法實(shí)驗(yàn)

  ELISA是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)縮寫(xiě)，是免疫檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，創(chuàng)始人是由由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次提出。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是一種廣泛應(yīng)用于生物分子檢測(cè)的免疫學(xué)技術(shù)，以其操作相對(duì)簡(jiǎn)單、靈敏度高和可進(jìn)行一定程度的并行檢測(cè)而受到科研領(lǐng)域的歡迎。ELISA可用于檢測(cè)和定量各種生物分子，包括激素、糖蛋白、蛋白質(zhì)、抗體和抗原等。其基本原理是利用抗原與抗體之間的特異性相互作用來(lái)識(shí)別和定量目標(biāo)分子。

圖1 elisa夾心法原理圖

  ELISA的具體操作步驟會(huì)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而有所差異，但通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：

  a、包被:將捕獲抗體或抗原包被在聚苯乙烯微孔板上。

  b、封閉:用無(wú)關(guān)蛋白封閉板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

  c、加樣:加入待測(cè)樣本，使目標(biāo)分子與包被的抗體或抗原結(jié)合。

  d、洗滌:洗去未結(jié)合的物質(zhì)。

  e、結(jié)合檢測(cè)抗體:加入酶標(biāo)檢測(cè)抗體，與目標(biāo)分子結(jié)合。(根據(jù)ELISA類(lèi)型，這一步可能與步驟3合并)

  f、洗滌:洗去未結(jié)合的檢測(cè)抗體。

  g、添加底物:加入酶的底物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，例如顏色變化或發(fā)光。

  h、信號(hào)檢測(cè):使用酶標(biāo)儀讀取信號(hào)強(qiáng)度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)分子的濃度。

  ELISA的類(lèi)型多種多樣，包括直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA，每種類(lèi)型都有其特定的應(yīng)用場(chǎng)景和優(yōu)缺點(diǎn)。雖然ELISA具有諸多優(yōu)勢(shì)，但也存在一些局限性，例如可能受到樣本基質(zhì)效應(yīng)的影響，以及某些情況下特異性不夠高等。

  二、蛋白質(zhì)印跡法

  蛋白質(zhì)印跡法是一種廣泛使用的分析技術(shù)，用于從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中檢測(cè)和分析特定蛋白質(zhì)。它主要包括3個(gè)步驟：在凝膠上分離蛋白質(zhì)、將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體膜上以及通過(guò)使用一抗和二抗標(biāo)記蛋白質(zhì)來(lái)可視化蛋白質(zhì)。

圖2 化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)示意圖

  蛋白質(zhì)印跡法技術(shù)由HarryTowbin于1979年首次描述，并由W.NealBurnette于1981年命名。蛋白質(zhì)印跡法步驟如下：

  a、凝膠電泳：使用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品。此步驟通常使用SDS-PAGE。

  b、轉(zhuǎn)移：分離的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到固體支持物上，如硝酸纖維素或聚偏二氟乙烯膜。

  c、總蛋白染色：使用諸如PonceauS、CoomasieR-350或酰胺黑等染料對(duì)膜進(jìn)行染色，從而使轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白質(zhì)可視化。

  d、阻斷：此步驟是為了阻斷膜與下一步將應(yīng)用的抗體之間的相互作用。由于目標(biāo)分子和抗體都是蛋白質(zhì)，因此膜有可能與抗體相互作用。

  e、孵育：在膜上檢測(cè)帶有報(bào)告酶的抗體。在膜表面涂上針對(duì)該酶的特異性底物。如果發(fā)生結(jié)合，就會(huì)產(chǎn)生比色反應(yīng)。

  f、檢測(cè)和可視化：未結(jié)合的探針被洗掉，凝膠中可見(jiàn)結(jié)合的蛋白質(zhì)。

  ELISA與WesternBlot區(qū)別

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)	蛋白質(zhì)印跡法
定義
ELISA 是一種免疫吸附試驗(yàn)，用于檢測(cè)樣本中的抗體或抗原。	蛋白質(zhì)印跡法是一種用于從混合物中分離和識(shí)別蛋白質(zhì)的分析技術(shù)。
定量
定性和定量	定性和半定量
凝膠電泳
不需要凝膠電泳步驟	需要凝膠電泳步驟
成本
較低	較高

  常見(jiàn)問(wèn)題

  問(wèn)題1、檢測(cè)樣本蛋白質(zhì)，可以用ELISA代替WesternBlot嗎？

  ELISA可以代替蛋白質(zhì)印跡法，因?yàn)樗且环N更靈敏的方法。但蛋白質(zhì)印跡法能給出更具體、更準(zhǔn)確的結(jié)果。

  問(wèn)題2、ELISA是定性還是定量檢測(cè)？

  Elisa可以提供定性，也可以提供定量檢測(cè)

  問(wèn)題3、ELISA和Westernblot哪個(gè)更準(zhǔn)確？

  通常使用蛋白質(zhì)印跡法來(lái)確認(rèn)ELISA的結(jié)果。兩種技術(shù)的結(jié)果準(zhǔn)確率均為99.9%。

  問(wèn)題4、elisa檢測(cè)有哪些優(yōu)勢(shì)？

  Elisa檢測(cè)成本相對(duì)較低，其次是操作簡(jiǎn)單，具有高特異性和靈敏度。

  問(wèn)題5、與ELISA相比，Westernblot有何優(yōu)勢(shì)？

  與ELISA相比，Westernblot的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它是一種高度特異性的技術(shù)。用于轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜具有很高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力和化學(xué)穩(wěn)定性。

  上述是ELISA和Westernblot介紹，相信你對(duì)兩者之間的區(qū)別有所了解。如果實(shí)驗(yàn)是為了驗(yàn)證基因表達(dá)、蛋白質(zhì)修飾分析和蛋白質(zhì)純化監(jiān)測(cè)等比較推薦Westernblot。