ELISA試劑盒具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、重復性好等優(yōu)點，成為科研工作者和臨床醫(yī)生的重要工具。但ELISA操作要具備專業(yè)操作，在實驗前能正確了解ELISA實驗說明書，可以提高實驗的準確性，避免實驗假陽性發(fā)生。

  

  ELISA試劑盒說明書

  

  ELISA試劑盒組成

  

  現(xiàn)已開發(fā)了多種試劑盒來簡化 ELISA 實驗，并加速、簡化和標準化每種 ELISA 的流程?，F(xiàn)已開發(fā)試劑來提升特異性、可重復性和靈敏性，并最大程度降低成本。但沒有預制試劑盒來評估某種特殊目的靶標時，實驗者可以制備平板和必要的試劑。以下是有關一個 ELISA 實驗所需的組分的概述。

  

  一、樣品制備

  

  多個樣品類型（如血液、尿液和裂解細胞）都常規(guī)通過 ELISA 進行分析。樣品制備將取決于待解決的特殊問題。在血清中測定分泌蛋白（如細胞因子）的方法可直接使用，或者在某些情況下，至少需要清除步驟。在光譜的另一端，要檢測翻譯后修飾，這一般需要用含蛋白酶/磷酸酶抑制劑的緩沖液進行細胞裂解。樣品制備會大大地改變實驗和實驗結果，因此這需要仔細考慮。

  

  二、緩沖液

  

  一個 ELISA 實驗需要多種緩沖液。這些包括包被、封閉、洗滌、稀釋、捕獲和檢測緩沖液。這些緩沖液的基本配方廣泛提供，但多數(shù)為市售商品，可以節(jié)省時間，并為研究人員提升質控：

  

  包被緩沖液 - 這種緩沖液可用來穩(wěn)定某種抗原或抗體，從而促進抗原或抗體被吸收到孔的表面?？乖虬豢贵w與塑料孔之間的相互作用會產生吸收和固定。這種被動結合受多種因素影響，包括塑料的表面化學性質、溫度、包被緩沖液的 pH 值、抗原/抗體濃度和時間。常用的包被緩沖液包括磷酸鹽緩沖生理鹽水 (PBS)、碳酸氫鈉或類似緩沖液，但應測試和優(yōu)化這些條件。重要的是，包被緩沖液不應含有會競爭地結合抗原或抗體的蛋白。

  

  封閉緩沖液 - 這種緩沖液能防止檢測抗體非特異性地結合平板表面。這種緩沖液要么含有會封閉結合位點的蛋白，要么含有會防止結合的去垢劑?；诘鞍椎姆忾]緩沖液僅在包被步驟之后才可以添加，因為溶液中的蛋白會被吸附到塑料上所有未結合位點上。像包被分析物或抗體一樣，任何洗滌步驟都不會去除這些非特異性蛋白。封閉緩沖液需要優(yōu)化，才能達到最大靈敏度和最低背景，并且不應含有會干擾檢測抗體的組分。

  

  洗滌緩沖液 - 這些緩沖液在各步驟之間用來去除所有未結合的物質，并需要在使用后完全去除。洗滌次數(shù)、每次洗滌的時長以及緩沖液中的去垢劑含量需要進行優(yōu)化。

  

  檢測緩沖液 - 這些緩沖液含有被抗體-酶復合體催化的所需底物。這些底物多數(shù)對緩沖條件具有靈敏性，因此在考慮新的檢測化學成份時，必須考慮裂解緩沖液和其他添加物，以減少檢測分子出現(xiàn)非特異性裂解。

  

  三、微孔板

  

  可以用多種微孔板樣式進行 ELISA，包括 96 孔微孔測試條、96-、384- 和 1536-孔板。

  

  最常見的平板有平坦孔底，并且由聚苯乙烯制成。平板用多種方式處理，以產生疏水/親水或特異性反應部分。

  

  例如，使用蛋白 A 來更特異性地結合表面。選擇優(yōu)質平板和表面包被有利于降低背景，并增強結合。

  

  檢測化學成份通常會影響平板顏色選擇：發(fā)色法為透明色，熒光法為黑色，比色法為白色。

  

  四、ELISA 抗體

  

  為 ELISA 選擇的抗體應仔細選擇，并驗證使用。根據所選抗體能否高度特異性地結合目的抗原，可預測實驗是否成功和結果是否可靠。除了特異性，選擇的抗體還應對抗原具有較高的親和力和親合力。換言之，抗體應結合在一種物種的一個抗原上的表位（特異性），這種結合應快速而有力（親和力），并且一旦結合，抗體-抗原復合體應穩(wěn)定（親合力）。

  

  為夾心檢測選擇的抗體更復雜，因為每種抗體需要定向一個不同的表位。根據實驗需要，夾心檢測的 2 種抗體可以來源于不同物種或相同物種。

  

  在 ELISA 中可使用單克隆抗體和多克隆抗體，但兩者都能提供某些有利于實驗者的優(yōu)勢。

  

  在 ELISA 中使用單克隆抗體或多克隆抗體的優(yōu)勢

  

  單克隆抗體：

  

  對一個表位有特異性，因此它們不會干擾其他抗體結合抗原的其他區(qū)域

  

  不太可能非特異性地結合其他抗原

  

  可用于一個 ELISA 的所有步驟

  

  作為非競爭性抗體匹配對的一部分，對夾心 ELISA 尤其有用

  

  多克隆抗體：

  

  可檢測同一抗原上不同表位的抗體并集

  

  可能會檢測一個靶蛋白上的多個結合位點，因此可提供更穩(wěn)定的信號

  

  對于需要用某種酶（如 HRP 或 AP）標記的抗體，標記效率、批間變化和偶聯(lián)后的一致性結合都是設計一個高質量實驗需要處理的問題。

  

  五、ELISA 對照

  

  對照對確保每份樣品產生的信號在生理學上都是準確的非常重要。可以合并使用一組對照來驗證一個 ELISA 實驗的有效性。有如下對照：

  

  空白對照可用來提供背景信號參考，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度，而不是實驗設置的人為結果。

  

  陽性和陰性對照可用來比較分析物產生的信號。

  

  加標對照可用來給出有關某種特殊樣品基質中分析物發(fā)現(xiàn)程度的信息，從而表明檢測性能。

  

  六、微孔讀板機

  

  所選擇的微孔讀板機應匹配 ELISA 中使用的檢測類型。比色反應的靈敏度最低，其次是化學發(fā)光和熒光反應。使用的檢測類型應根據樣品分析物數(shù)量以及是否需要放大和/或多重分析來決定。重要的是，用特定微孔讀板機檢測的動態(tài)范圍和靈敏度應該還會影響檢測方法的選擇。

  

  Elisa試劑盒方法類型

  

  Elisa試劑盒方法分為競爭elisa法、夾心法elisa、直接elisa法和間接elisa法等。

4種elisa法介紹

  

  一、直接 ELISA法

  

  直接 ELISA 技術涉及將抗原固定在聚苯乙烯微孔板上，然后使用蛋白質（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA 或任何其他動物蛋白）封閉微孔板。然后，洗滌板并與一抗一起孵育。

  

  在此測定中，一抗直接與底物（例如 HRP 或 AP）結合，導致顏色變化。由于過程中只涉及較少的步驟，直接 ELISA 是一種適用于實驗室工作流程的快速技術，同時還消除了二抗交叉反應。但其缺點是反應靈敏度低、成本低。

直接ELISA法

  

  二、間接 ELISA法

  

  該技術的步驟與直接 ELISA 類似。唯一的區(qū)別是涉及額外的洗滌步驟以及該過程中使用的抗體類型。

  

  間接 ELISA工作流程中 涉及兩種類型的抗體：一抗和二抗。

  

  首先添加一抗并洗滌，然后與標記的二抗一起孵育。

  

  間接 ELISA 的優(yōu)點是成本較低、更加靈敏和靈活。然而，由于二抗的存在，檢測過程中存在交叉反應的可能性。

  

  三、夾心ELISA法

  

  在此測定中，抗原夾在兩種抗體之間。這就是該測定被稱為夾心 ELISA 的原因。該測定首先使用捕獲抗體包被微孔板表面，用 BSA 封閉表面，然后向微孔板中添加抗原，持續(xù)約 90 分鐘。

  

  孵育步驟后，用緩沖液清洗板，然后與標記的二抗一起孵育。然后，添加底物來研究和測量反應信號。

  

  盡管夾心 ELISA 具有最高的靈敏度，但其主要缺點是該過程所需的時間和費用。此外，尋找完美抗原抗體對的必要性也是該測定的限制。

夾心elisa法

  

  四、競爭性 ELISA

  

  該測定檢測測試樣品中抗原特異性抗體的存在。它涉及使用兩種抗體：樣品中存在的抗體和酶聯(lián)抗體。它們在反應過程中競爭抗原。沒有顏色代表陽性測試結果，而有顏色則代表陰性測試結果。

  

  該測定法不能用于經過任何程度稀釋的樣品，并且靈敏度較低。然而，它有許多優(yōu)點，例如需要較少的樣品純化、較小的變異性以及分析樣品中的一系列抗原。

  

  Elisa試劑盒步驟

  

  雖然不同類型 ELISA 的實驗方案有所不同，但應考慮大多數(shù)檢測中常見的步驟如下：

elisa流程圖

  

  板材涂層

  

  大多數(shù) ELISA 的第一步是將檢測的第一個組分與測試板結合。這通常是通過被動吸附來完成的，這是一個非特異性過程，因此結果將取決于施加到板上的內容。如果應用含有抗原的樣品，則結果是仍然需要選擇性步驟的板，因為將結合各種抗原，而不僅僅是感興趣的抗原。然而，如果應用純化的抗原（如用于抗體檢測的間接 ELISA 的情況）或捕獲抗體（如夾心 ELISA 的情況），那么結果就是一塊已經具有選擇性特性的板。

  

  根據檢測的目標和性質，可以使用多種板類型，其中大多數(shù)是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，具有不同的結合特性。一些目標，包括高度糖基化的蛋白質、碳水化合物、DNA、脂質、短肽和蛋白質，在去垢劑存在下，不能很好地吸附。在這些情況下，建議使用經過處理以允許與表面共價連接的板。

  

  孵化

  

  將試劑添加到 ELISA 板后，必須對其進行孵育，以便有時間進行結合或反應。每次孵育的溫度和持續(xù)時間將取決于測定步驟和所執(zhí)行的操作。通常在 37 ° C下孵育 1 小時，例如在上樣后。然而，諸如封閉之類的步驟可以在冰箱中進行過夜，并且檢測期間的孵育通常在室溫下進行更短的時間。

  

  洗滌

  

  洗板是應用測定的每個成分直至檢測之間的重要步驟。清空孔中的溶液后，用緩沖液（通常是磷酸鹽緩沖鹽水-Tween 20 (PBST) ）清洗孔，以去除任何殘留的未結合抗原、抗體或試劑。這可以使用多通道移液器手動完成或使用自動洗板機完成。清洗不充分可能會導致背景信號較高，而清洗過多可能會導致樣品信號較低。不一致的洗滌可能會導致整個板的不一致，從而導致結果不可靠。

  

  封閉

  

  用蛋白質包被 ELISA 板后，通常需要進行封閉，以防止后續(xù)操作步驟中檢測抗體的任何非特異性結合（圖 2）。將與測定無關的混合蛋白質添加到板中并在板中孵育，占據任何可用的非特異性結合位點。常見的蛋白質封閉緩沖液選擇包括脫脂奶粉、牛血清白蛋白 (BSA) 和酪蛋白?；蛘?，非離子去污劑，如 Tween 20 或 Triton X-100，可用作封閉劑，但不能提供像蛋白質一樣的永久封閉。無效的板封閉會導致背景噪音增加并降低測定的靈敏度和特異性。

封閉過程如何防止非特異性結合

  

  抗體

  

  實驗抗體是大多數(shù) ELISA 的基石，選擇正確的抗體至關重要，尤其是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，每種抗體都有自己的優(yōu)點和局限性。單克隆抗體具有較高的特異性，但成本較高。另一方面，多克隆抗體可以在多個結合位點結合靶標，從而放大信號并提高靈敏度。

  

  使用二抗的方法增加了額外的步驟，延長了測定時間，增加了出錯的機會，并且需要更多的優(yōu)化來找到合適的相容抗體對。然而，使用多克隆二抗所帶來的靈敏度增益可能使得這對于開發(fā)有效的測定是有價值的或必要的。

  

  檢測

  

  無論使用哪種 ELISA 類型，都以檢測步驟結束，最常見的是利用酶介導的可見顏色變化化學，然后可以使用紫外-可見分光光度法進行測量。將酶結合的抗原或抗體施加到測試孔中，如果其目標存在，它將結合。當酶的適當?shù)孜锾砑拥桨逯袝r，它會引起顏色變化，顏色變化與孔內結合的靶標量成正比。辣根過氧化物酶 (HRP) 是一種常見的綴合物，與底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 配合使用，它會因 HRP 的反應而變成藍色，然后在添加硫酸溶液時變成黃色，從而停止的反應。

  

  然后可以使用酶標儀（添加終止液后的 TMB 為 450 nm）（一種紫外-可見分光光度計）確定每個孔的吸光度值，并進行校正和計算，例如減去平均空白根據測定設計進行孔值、技術重復的平均或與標準的比率計算。

  

  ELISA試劑盒注意事項及安全說明

  

  一、防范措施

  

  1.本試劑盒僅供研究使用，不可用于診斷或治療程序。

  

  2. 試劑盒不得超過有效期使用。

  

  3. 請勿混合不同批次的試劑。

  

  4. 試劑盒的設計和測試旨在檢測手冊中所示的特定目標和樣品。將此套件用于其他目的應由最終用戶仔細驗證。

  

  二、安全守則

  

  1.本試劑盒提供的終止液是酸性溶液。使用試劑時要小心，避免風險。

  

  2. 所有生物材料均應按照當?shù)胤煞ㄒ?guī)作為潛在危險進行處理和丟棄。

  

  3.出于安全考慮，實驗中需要個人防護裝備，如實驗服、手套、手術口罩和護目鏡。

  

  如何有效利用ELISA試劑盒使用說明書

  

  在生物醫(yī)學研究領域，ELISA試劑盒作為一種常用的實驗工具，其使用說明書的正確利用對于確保實驗結果的準確性和可靠性至關重要。那么，如何有效利用ELISA試劑盒使用說明書呢？

  

  首先，仔細閱讀并全面理解說明書的內容是關鍵。用戶應仔細研讀說明書，確保對試劑盒的組成、試劑的用途、實驗步驟、反應條件以及注意事項等有清晰的認識。這有助于用戶更好地掌握實驗的關鍵環(huán)節(jié)，避免在操作過程中出現(xiàn)錯誤或遺漏。

  

  其次，遵循說明書中的操作步驟和注意事項至關重要。說明書中的操作步驟是經過精心設計和驗證的，遵循這些步驟可以確保實驗的準確性和可重復性。同時，說明書中的注意事項也是實驗成功的關鍵，用戶應嚴格按照要求進行操作，避免出現(xiàn)安全問題或實驗失敗的情況。

  

  此外，當遇到實驗問題或異常結果時，用戶應及時查閱說明書中的故障排除部分。說明書中通常會提供一些常見問題的解決方案，用戶可以根據這些建議進行排查和調整，從而快速解決問題并恢復實驗的正常進行。

  

  最后，用戶還應關注說明書的更新與版本變化。隨著科研技術的不斷進步和試劑盒的不斷優(yōu)化，說明書的內容也可能會有所更新。因此，用戶應定期查看說明書的最新版本，以便了解最新的實驗方法和操作要求，確保實驗的準確性和可靠性。

  

  總之，有效利用ELISA試劑盒使用說明書是提升科研效率與準確性的重要途徑。用戶應仔細閱讀、遵循說明書的要求，并及時查閱更新內容，以確保實驗的順利進行和結果的可靠性。

  

  上述是elisa試劑盒說明書介紹，通過上述的介紹，大家對elisa有個簡單認識。大家在購買的elisa試劑盒通常會自帶說明書，在實驗前可以仔細越多說明書，了解實驗的注意事項和試劑存儲方法。