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品質保證 · 通蔚試劑

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產品中心

  • 丹毒絲菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

    規(guī)格:
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW37676
    • 應用 : 僅供科研使用
    • 貨期 : 現貨
    • 規(guī)格 :50次
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產品及特點: 
1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據丹毒絲菌屬通用保守序列設計的專一性引物,與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測,避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
規(guī)格及成分:

編號

成分

規(guī)格

試劑一

2×qPCR MagicMix

500 μL(棕色管)

試劑二

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1 mL(黃蓋)

試劑三

丹毒絲菌屬通用染料法PCR 引物混合液

100 μL(白蓋)

試劑四

丹毒絲菌屬通用染料法PCR 陽性對照(1×10E8 /μL)

50 μL(紅蓋)

試劑五

DNA 病毒裂解液(試用裝)

15 次(9 mL)

 

使用手冊

1 份

運輸及保存:
低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。
自備試劑:
DNA模板、10×ROX(根據機型決定,具體見使用方法)。
使用方法:
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例):
1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備:
8. 如果有 N 個樣品,必須設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當于 1 萬拷貝)或第 5 號(濃度為 1×10E5拷貝/μL,10μL 相當于 10 萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品,則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒DNAout。
三、設置qPCR反應(20μL體系,在樣品制備室進行):
10. 如果只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復,則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

成分

樣品管 N+2個

PCR陰性對照管

PCR陽性對照管(2-7管)

2×qPCR MagicMix(棕色管)

10μL

10μL

10μL

丹毒絲菌屬通用PCR引物混合液(白蓋)

2μL

2μL

2μL

自備10×ROX(見注)

2μL

2μL

2μL

N+2待測樣品DNA模板

6μL

不加

不加

7步所得PCR陽性對照稀釋液(2-7號)

不加

不加

6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

注: 僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。
12.蓋上蓋子后上機,按下面參數進行PCR(具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優(yōu)化)。

過程

溫度

時間

預變性

92℃

5分鐘

PCR反應30個循環(huán)

94℃

60秒

50℃

60秒

72℃

60秒

13.數據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時,最大吸收光譜在471nm,結合DNA時的最大吸收光譜在500nm,最大發(fā)射光譜在530nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數據處理:
14.如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct值應該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
五、特別提示:
本公司的所有產品,僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
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