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產(chǎn)品及特點(diǎn)：
BK病毒(BKVirus、BKV)是在一位腎移植后出現(xiàn)腎功能衰竭伴輸尿管狹窄患者的尿液樣本中首次分離得到的一種新型的病毒,隨著器官移植術(shù)的廣泛開展及強(qiáng)效免疫抑制劑的使用,BK感染已成為腎臟移植后功能喪失及骨髓移植后急性腎功能衰竭的重要原因。
BKV原發(fā)感染多集中在嬰幼兒時(shí)期,通常無明顯的臨床癥狀,或表現(xiàn)為發(fā)熱、輕微呼吸道感染癥狀，對(duì)人體的腎功能有巨大危害，因此BK病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的BK病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)BK病毒(BKVirus、BKV)保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
規(guī)格及成分：
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編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
2×qPCRMagicMix |
500μL(棕色管) |
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試劑二 |
熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL(黃蓋) |
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試劑三 |
BK病毒(BKVirus、BKV)染料法PCR引物混合液 |
100μL(白蓋) |
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試劑四 |
BK病毒(BKVirus、BKV)染料法PCR陽性對(duì)照(1×10E8/μL) |
50μL(紅蓋) |
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試劑五 |
DNA病毒裂解液(試用裝) |
15次(9mL) |
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使用手冊 |
1份 |
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA模板、10×ROX(根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法)。
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對(duì)照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)：
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對(duì)照。
2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭，下同)。
4. 在7號(hào)管中加入5μL1×10E8拷貝/μL的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽性對(duì)照)，一個(gè)是NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用10μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)(濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(hào)(濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送15次一管式病毒DNAout。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行)：
10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加)：
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成分 |
樣品管 N+2個(gè) |
PCR陰性對(duì)照管 |
PCR陽性對(duì)照管(2-7管) |
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2×qPCR MagicMix(棕色管) |
10μL |
10μL |
各10μL |
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BK病毒(BKVirus、BKV)PCR引物混合液(白蓋） |
2μL |
2μL |
各2μL |
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自備10×ROX(見注) |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2待測樣品DNA模板 |
6μL |
不加 |
不加 |
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第7步所得PCR陽性對(duì)照稀釋液(2-7號(hào)) |
不加 |
不加 |
各6μL2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管 |
12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。
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過程 |
溫度 |
時(shí)間 |
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預(yù)變性 |
92℃ |
5分鐘 |
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PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán) |
94℃ |
60秒 |
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50℃ |
60秒 |
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72℃ |
60秒 |
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，最大吸收光譜在471nm，結(jié)合DNA時(shí)的最大吸收光譜在500nm，最大發(fā)射光譜在530nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理：
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
