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小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA檢測(cè)試劑盒是一款用于體外定量檢測(cè)小鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)含量的試劑盒。本產(chǎn)品采用雙抗體一步夾心法，具有高靈敏度、高特異性和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、藥物開(kāi)發(fā)和疾病診斷等領(lǐng)域。
- 有效期：6個(gè)月
- 保存條件：2-8℃
- 種屬：小鼠
- 檢測(cè)方法：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法
實(shí)驗(yàn)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，小鼠脂肪酸合成酶抑制劑（FASI）試劑盒因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
需要而未提供的試劑和器材
- 酶標(biāo)儀（450nm）
- 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
- 37℃恒溫箱
- 蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
| 名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
| 微孔酶標(biāo)板 | 8孔 x 12條 |
8孔 x 6條 |
無(wú) |
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.3mL * 6管 |
0.3mL * 6管 |
無(wú) |
| 樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 檢測(cè)抗體- HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
| 20 x 洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋 |
| 底物A |
6mL |
3mL |
無(wú) |
| 底物B |
6mL |
3mL |
無(wú) |
| 終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 封板膜 | 2張 | 2張 | 無(wú) |
| 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 | 無(wú) |
| 白封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無(wú) |
| 空白稀釋板 | 1塊 | 1塊 | 選配 |
| 橡膠手套 | 2副 | 2副 | 選配 |
備注
- 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、3.75 ng/mL
- 經(jīng)過(guò)大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過(guò)最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
- 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
- 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。
- 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
- 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
- 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
- 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
- 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
- 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
- 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。
- 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
試劑準(zhǔn)備
小鼠脂肪酸合成酶抑制劑（FASI）試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
- 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
- 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
- 樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。
- 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
- 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
- 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
- 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。
試劑盒性能
- 檢測(cè)范圍：3.75 ng/mL – 120 ng/mL。
- 靈敏度：最低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL。
- 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
- 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。
說(shuō)明
- 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
- 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
- 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考。
- 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。
- 本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
- 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。
- 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。
- 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。
